DNA SAFLAŞTIRMA

 DNA saflaştırmanın ilk adımı DNA'nın elde edileceği hücrelerin yıkılarak açılmasıdır. Bazı malzemelerle bu adım daha kolaydır. Örneğin kültürü  yapılan hayvan hücreleri, hücre zarlarını dağıtıp hücre içeriğini serbest bırakan sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi bir deterjan eklenerek kolaylıkla yıkılıp açılmaktadır. Diğer hücre tipleri güçlü duvarlara sahiptir ve dolayısıyla daha şiddetli uygulamalar gerekmektedir. Bu durumda bitki hücresi genellikle dondurulmaktadır. Daha sonra havan ve tokmak kullanılarak ezilmektedir. Bu süreçte selüloz duvarlarının yıkılmasında etkili bir yol olarak görev almaktadır. E.coli olarak bakteriler enzimatik ve kimyasal uygulamaların bir kombinasyonuyla parçalanmaktadır. Kullanılan  enzim bakteri hücre duvarının polimerik bileşiklerini yıkan yumurta beyazıdan elde edilen lizozim ve kimyasal  hücre duvarının sağlamlığını daha fazla düşüren magnezyum iyonlarını tutan etilendiamin tetraasetat'dır (EDTA). Bir deterjan ilavesiyle hücre zarının bozulması, sonrasında hücrlerin patlamasına neden olmaktadır. Bir kez hücreler yıkılmışsa oluşan özütten DNA saflaştırmak için iki farklı yaklaşım kullanılmaktadır. İlki DNA haricinde tüm hücre bileşenlerinin yıkılması veya uzaklaştırılmasını kapsamaktadır. Bu metot, hücreler çok fazla lipit  veya karbohidrat içermiyorsa en iyi şekilde çalışılmaktadır. Özüt, tüpün dibinde pelet şeklinde hücre duvarı parçaları gibi kalıntıları uzaklaştırmak için önce düşük hızda santrifüj edilmektedir. Üst fazda bbaşka bir deney tüpüne aktarılır ve organik ve sulu katmanlar arasındaki arafazda proteinlerin çökelmesine neden olan fenol ile karıştırılmaktadır. Çözünmüş nükleik asitleri içeren sulu katman toplanır ve RNA'yı nükleotitlerin bir karışımı ve kısa oligonükleotitlere parçalayan bir ribonükleaz enzimi eklenmektedir. Bütün halinde kalan DNA polinükleotidleri şimdi etanol eklenerek çökeltilebilir, santrifüjle pelet haline getirilebilir ve uygun hacimde tampon içerisinde yeniden çözülmektedir.

     Şekil 1: Saflaştırılmış DNA [1]

DNA saflaştırmadaki ikincim yaklaşımda DNA dışında her şeyin yıkılmasındansa, DNA' nın kendisi özütten seçici olarak uzaklaştırılmaktadır. Bunu yapmanın bir yolu, bir kromatografi rezinindeki elektrik yüklü partiküllere ne kadar sıı bağlandığına göre molekülleri ayıran iyon değiştirici kromatografidir. DNA ve RNA' nın her ikisi de bazı proteinler gibi negatif yüklüdür ve dolayısıyla pozitif yüklü resine bağlanırlar. İyon değiştirici kromotografiyi  yapmanın en kolay yolu resini bir kolon içerisine yerleştirmek ve hücre özütünü üst düzeyine eklemektir. Özüt kolondan geçer ve tüm negatif yüklü moleküller resine bağlanmaktadır. İyonik etkileşimleri içeren bağlanma bir tuz konsantrasyonlarında resinden ayrılmaktadır. Bu da demek oluyor ki, şayet tuz konsantrasyonu aşamalı olarak artan bir çözelti kolondan geçirilirse farklı molekül çeşitleri göreceli bağlanma kuvvetlerini yansıtacak şekilde protein, RNA ve DNA art arda ayrışmaktadır. Aslında bu kadar dikkali bir ayırım genellikle gerekmez. Sadece iki farklı tuz konsantrasyonu kullanılır, biri protein ve RNA' yı ayrışmada etkin olan ve sadece DNA'yı bağlı  bırakan pH 7.0' de 1.0 M NaCl  içerir, takiben protein ve RNA kontaminantları olmaksızın DNA ayrıştıran pH 8.5'te 1.25 M NaCl içeren ikinci bir çözelti gelmektedir.

Kaynak

1.https://images.app.goo.gl/7qWEziz5hZ6PkgM17