MUTASYON TAYİNİ
Birçok genetik hastalık bir gen ürünün modifikasyonu veya etkisizleştirilmesiyle sonuçlanan nokta mutasyonlarından kaynaklanabilir. Bu mutasyonlar tayin yöntemleri iki bakımdan önemlidir. Birincisi, bir genetik hastalıktan sorumlu bir gen ilk tanımlandığında, hastalığın durumunda sorumlu mutasyonu veya mutasyonları tanımlamak için bu genin farklı bireylerdeki birçok versiyonun incelenmesi gereklidir. İkincisi, hastalığa neden olan bir mutasyon karakterize edildiğinde yüksek etkinlikte saptama yöntemlerine gerek olduğu için hekimler mutasyonu taşıyan ve hastalık geliştirme veya onu çocuklarına geçirme riski olan bireyleri tanımlamak için çok sayıdaki DNA örneğini tarayabilirler.
Herhangi bir mutasyon DNA dizilenmesi ile tanımlanabilir, ancak dizileme nispeten yavaştır ve çok sayıdaki örneğin taranması için uygun olmayacaktır. DNA çip teknolojisi de uygulanabilmektedir. Ancak bu da henüz yaygın biçimde uygun bir seçenek değildir. Bu nedenlerle birçok düşük teknoloji yöntemi tasarlanmıştır. Bunlar iki sınıfa ayrılabilir. Bir mutasyon pozisyonu hakkında ön bilgiye gerek duymayan mutasyon tarama teknikleri ve spesifik bir mutasyonun olup oladığını tayin eden mutasyon arama teknikleri.
Çoğu mutasyon tarama tekniği mutasyona uğramamış olan kontrol DNA'nın tamamlayıcı ipliği ve incelenmekte olan DNA' nın tek ipliği arasında oluşan heterodupleksin analizini kapsar. Eğer test DNA bir mutasyon taşıyorsa heteroduplekste baz çiftinin oluşmadığı yerde tek bir yanlış eşleşme pozisyonu bulunacaktır. Bu yanlış eşleşmenin bulunup bulunmadığını belirlemek için birçok teknik kullanılabilir.
Elektroforez veya yüksek perfonmaslı sıvı kromatografisi (HPLC) yanlış eşleşmeyi poliakrilamit bir jel veya HPLC kolonundaki yanlış eşleşmeli hibritin tam baz eşleşmeli bir hibritle karşılaştırıldığında, hareketliliğindeki farklılığı tanımlayarak saptayabilir. Bu yaklaşım bir yanlış eşleşme varsa belirler ancak mutasyonun test DNA' nın neresinde bulunduğuna ait bil vermemektedir.
Heterodupleksin yanlış eşleşme pozisyonundan kesilmesini takiben jel elektroforezi bir yanlış eşleşme pozisyonunun yerini tayin eder. Eğer heeroduplesk bütün kalırsa o zamana yanlış eşleşme taşır. Test DNA' sındaki mutasyonun pozisyonu kesim ürünlerinin boyutlarıyla belirlenir. Kesim, esasen çift iplikli olan DNA' nın tek iplikli bölgelerini kesen enzimler veya kimyasallarla muamele ile eğer kontrol DNA ile test DNA' sının RNA versiyonu arasında bir hibrit oluşmuşsa S1 gibi tek ipliğe özgü bir ribonükleaz ile yapılır.
Çoğu arama tekniği özgün mutasyonların saptanması için oligonükleotit hibritleşmenin dizileri sadece bir nükleotit pozisyonunda farklılaşan hedef DNA'lar arasında ayrım yapma yeteneğini kullanır. Alel spesifik oligonükleotit (ASO) hibritlemede DNA örnekleri sadece mutant diziyle hibritleşen bir oligonükleotitle problanmasıyla taranır. Bu etkili, ancak uzun soluklu bir yöntemdir. DNA örnekleri genellikle klinik izolatların PCR'ı ile elde edildiğinden daha hızlı bir alternatif PCR primerlerinden birini tanısal oligonükleotit olarak kullanılmaktadır. Böylece test DNA'sındaki mutasyonun varlığı veya yokluğu bir PCR ürünün sentezlemesi veya sentezlenmemesi ile belirlenir.
Harika
YanıtlaSil