DNA Ligaz

 DNA ligaz, bir fosfodiester bağı oluşumunu katalize ederek DNA zincirlerinin birbirine bağlanmasını kolaylaştıran spesifik bir enzim türüdür, bir ligazdır (EC 6.5.1.1). Canlı organizmalarda dupleks DNA'daki tek zincir kırıklarının onarılmasında rol oynar, ancak bazı formlar (DNA ligaz IV gibi) çift sarmal kopmalarını (yani DNA'nın her iki tamamlayıcı sarmalındaki bir kopma) spesifik olarak onarabilir. Tek iplikli kopmalar, DNA'yı tamamen onarmak için son fosfodiester bağını yaratan DNA ligazıyla, bir şablon olarak çift sarmalın tamamlayıcı ipliği kullanılarak DNA ligaz tarafından onarılır. DNA ligaz, hem DNA onarımında hem de DNA replikasyonunda kullanılır. Ek olarak, DNA ligazı, rekombinant DNA deneyleri için moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Saflaştırılmış DNA ligazı, rekombinant DNA oluşturmak üzere DNA moleküllerini birleştirmek için gen klonlamasında kullanılmaktadır.

Enzimatik Mekanizma

DNA ligazın mekanizması, bir nükleotidin ("alıcı") 3' hidroksil uçları arasında, diğerinin ("verici") 5' fosfat ucu ile iki kovalent fosfodiester bağı oluşturmaktır. Oluşan her fosfodiester bağı için iki ATP molekülü tüketilir. Dört adımda ilerleyen ligaz reaksiyonu için AMP gereklidir:

1.DNA segmentlerindeki veya Okazaki fragmanlarındaki çentikler gibi aktivite bölgesinin yeniden düzenlenmesi.

2. Enzimin aktif merkezindeki bir lizin kalıntısının adenilasyonu (AMP eklenmesi), pirofosfat salınır;

3. AMP'nin donörün 5' fosfatına transferi, bir pirofosfat bağının oluşumu;

4. Vericinin 5' fosfatı ile alıcının 3' hidroksili arasında bir fosfodiester bağının oluşumu.

Ligaz, daha yüksek enzim konsantrasyonları ve farklı reaksiyon koşulları gerekli olmasına rağmen, kör uçlarla da çalışacaktır.

E. coli

E. coli DNA ligazı, lig geni tarafından kodlanır. Çoğu prokaryotta olduğu gibi E. coli'deki DNA ligazı, fosfodiester bağı oluşturmak için nikotinamid adenin dinükleotidi (NAD) parçalayarak kazanılan enerjiyi kullanır. Polietilen glikol ile moleküler kalabalık koşulları dışında künt uçlu DNA'yı bağlamaz ve RNA'yı DNA'ya verimli bir şekilde bağlayamaz.

E. coli DNA ligazının aktivitesi, doğru konsantrasyonlarda DNA polimeraz ile arttırılabilir. Geliştirme, yalnızca DNA polimeraz 1'in konsantrasyonları, bağlanacak DNA parçalarından çok daha düşük olduğunda çalışır. Pol I DNA polimerazların konsantrasyonları daha yüksek olduğunda, E. coli DNA ligazı üzerinde olumsuz etkisi vardır.

T4

Bakteriyofaj T4'ten (Escherichia coli bakterilerini enfekte eden bir bakteriyofaj) DNA ligazı. T4 ligaz, laboratuvar araştırmalarında en yaygın kullanılanıdır. DNA, oligonükleotitlerin yanı sıra RNA ve RNA-DNA hibritlerinin yapışkan veya kör uçlarını bağlayabilir, ancak tek sarmallı nükleik asitleri bağlayamaz. Ayrıca kör uçlu DNA'yı E. coli DNA ligazından çok daha yüksek bir verimlilikle bağlayabilir. E. coli DNA ligazından farklı olarak, T4 DNA ligazı NAD kullanamaz ve kofaktör olarak ATP'ye mutlak bir gereksinim vardır. T4 DNA ligazının in vitro aktivitesini geliştirmek için bazı mühendislikler yapılmıştır; örneğin başarılı bir yaklaşım, birkaç alternatif DNA bağlayıcı proteine ​​kaynaşmış T4 DNA ligazını test etti ve füzyon ortakları olarak p50 veya NF-kB'ye sahip yapıların klonlama amaçları için künt uç ligasyonlarda vahşi tipten %160'ın üzerinde daha aktif olduğunu buldu. T4 DNA ligaz. Bir plazmit vektörüne bir fragman eklemek için tipik bir reaksiyon, yaklaşık 0.01 (yapışkan uçlar) ila 1 (kör uçlar) ligaz birimi kullanır. T4 DNA ligaz için optimal inkübasyon sıcaklığı 16 °C'dir.

Bakteriyofaj T4 ligaz mutantları, hem UV ışımasına  hem de alkilleyici ajan metil metansülfonata karşı artan hassasiyete sahiptir ve bu, bu ajanların neden olduğu DNA hasarlarının onarımında DNA ligazının kullanıldığını gösterir.

Memeli

Memelilerde dört spesifik ligaz türü vardır.

1.DNA ligaz I: Ribonükleaz H, Okazaki parçalarından RNA primerini çıkardıktan sonra geciken ipliğin yeni oluşan DNA'sını bağlar.

2.DNA ligaz III: nükleotid eksizyon onarımı ve rekombinant fragmanlar işlemi sırasında DNA'nın sızdırmazlığına yardımcı olmak için DNA onarım proteini XRCC1 ile kompleksler. Bilinen tüm memeli DNA ligazlarından sadece Lig III'ün mitokondride mevcut olduğu bulunmuştur.

3.DNA ligaz IV: XRCC4 ile kompleksler. Homolog olmayan uç birleştirme DNA çift sarmallı kopma onarım yolundaki son adımı katalize eder. Ayrıca, bağışıklık sistemi gelişimi sırasında immünoglobulin ve T-hücresi reseptör lokuslarında çeşitlilik oluşturan süreç olan V(D)J rekombinasyonu için de gereklidir.

4.DNA ligaz II: DNA ligaz III'ün proteolitik bozunmasından kaynaklanan bir saflaştırma artefaktı. Başlangıçta, başka bir DNA ligazı olarak kabul edilmiştir ve DNA ligazlarının sıra dışı isimlendirilmesinin nedeni budur.

Ökaryotlardan ve bazı mikroplardan elde edilen DNA ligazı, NAD yerine adenozin trifosfat (ATP) kullanır.

Kaynak:

Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (November 2004). "Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA". nature. 432 (7016): 473–8. Bibcode:2004Natur.432..473P. doi:10.1038/nature03082. PMID 15565146. S2CID 3105417.

 Lehman IR (November 1974). "DNA ligase: structure, mechanism, and function". science. 186 (4166): 790–7. Bibcode:1974Sci...186..790L. doi:10.1126/science.186.4166.790. PMID 4377758. S2CID 86549159.

 Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiology: An Evolving Science (Second ed.). New York: W. W. Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.

 Yang Y, LiCata VJ (February 2018). "Pol I DNA polymerases stimulate DNA end-joining by Escherichia coli DNA ligase". Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (1): 13–18. doi:10.1016/j.bbrc.2018.01.165. PMID 29409896.

 "Ligases" (PDF). Enzyme Resources Guide. Promega Corporation. pp. 8–14.

 Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (July 2013). "Engineered DNA ligases with improved activities in vitro". Protein Engineering, Design & Selection. 26(7):471–8. doi:10.1093/protein/gzt024. PMID 23754529.

 Baldy MW (1968). "Repair and recombination in phage T4. II. Genes affecting UV sensitivity". Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 33: 333–8. doi:10.1101/sqb.1968.033.01.038. PMID 4891973.

 Baldy MW (February 1970). "The UV sensitivity of some early-function temperature-sensitive mutants of phage T4". virology 40 (2): 272–87. doi:10.1016/0042-6822(70)90403-4. PMID 4909413.

 Baldy MW, Strom B, Bernstein H (March 1971). "Repair of alkylated bacteriophage T4 deoxyribonucleic acid by a mechanism involving polynucleotide ligase". Journal of Virology. 7 (3): 407–8. doi:10.1128/JVI.7.3.407-408.1971. PMC 356131. ​​PMID 4927528.

 Tomkinson, Alan E; Sallmyr, Annahita (5 September 2013). "Structure and function of the DNA ligases encoded by the mammalian LIG3 gene". Again. 531 (2): 150–157.