CRISPR Prime Editing

 Birincil düzenleme, moleküler biyolojide canlı organizmaların genomunun değiştirilebileceği bir "ara ve değiştir" genom düzenleme teknolojisidir. Teknoloji, yeni genetik bilgiyi doğrudan hedeflenen bir DNA bölgesine yazar. Bir mühendislik ters transkriptaz enzimine kaynaşmış katalitik olarak bozulmuş bir Cas9 endonükleazından ve hedef bölgeyi tanımlayabilen ve hedef DNA nükleotidlerinin yerini alacak yeni genetik bilgiyi sağlayabilen bir birincil düzenleme kılavuzu RNA'dan (pegRNA) oluşan bir füzyon proteini kullanır. Çift iplik kopmalarına (DSB'ler) veya donör DNA şablonlarına ihtiyaç duymadan hedeflenen eklemelere, silmelere ve bazdan baza dönüşümlere aracılık eder.

Teknoloji, tıbbi genetikteki potansiyel kullanımları nedeniyle ana akım basının dikkatini çeken erken aşama, deneysel bir genom düzenleme yöntemidir. CRISPR/Cas9 ve temel düzenleyiciler dahil olmak üzere genom düzenleme teknolojilerinin öncüsü için benzer metodolojileri kullanır. 2019 itibariyle, hiçbir terapötik uygulama olmaksızın bilimsel bir kavram kanıtı olmaya devam etmektedir.

Şekil 1: Birincil düzenlemenin bileşenleri

Genom Düzenleme

Bileşenler

Prime düzenleme, üç ana bileşeni içerir:

1-(i) düzenlenecek hedef nükleotid dizisini tanımlama ve (ii) hedeflenen dizinin yerini alan yeni genetik bilgiyi kodlama yeteneğine sahip bir birincil düzenleme kılavuzu RNA (pegRNA). PegRNA, bir primer bağlama bölgesi (PBS) ve bir ters transkriptaz (RT) şablon dizisi içeren bir genişletilmiş tek kılavuz RNA'dan (sgRNA) oluşur. Genom düzenleme sırasında, primer bağlama bölgesi, çentikli DNA zincirinin 3' ucunun pegRNA'ya hibridize olmasına izin verirken, RT şablonu, düzenlenmiş genetik bilginin sentezi için bir şablon görevi görür.

2-Moloney Murine Lösemi Virüsü (M-MLV) ters transkriptazına kaynaşmış bir Cas9 H840A nickazından oluşan bir füzyon proteini.

3-Cas9 H840A nickaz: Cas9 enzimi, DNA dizilerini parçalayabilen iki nükleaz alanı, hedef olmayan ipliği parçalayan bir RuvC alanı ve hedef ipliği parçalayan bir HNH alanı içerir. 840º amino asit histidininin bir alanin ile değiştirildiği Cas9'a bir H840A ikamesinin eklenmesi, HNH alanını etkisiz hale getirir. Yalnızca RuvC işlev alanıyla, katalitik olarak bozulmuş Cas9, tek zincirli bir nick sunar, dolayısıyla nickaz adı

4-M-MLV ters transkriptaz: DNA'yı tek iplikli bir RNA şablonundan sentezleyen bir enzim.

5-Füzyon proteininin Cas9 H840A nickaz bölümünü, düzenlenmemiş DNA zincirini takmak için yönlendiren tek bir kılavuz RNA (sgRNA).

Şekil 2: Birincil düzenleme mekanizması

Mekanizma

Genomik düzenleme, hücrelerin pegRNA ve füzyon proteini ile transfekte edilmesiyle gerçekleşir. Transfeksiyon genellikle vektörleri bir hücreye sokarak gerçekleştirilir. Bir kez içselleştirildiğinde, füzyon proteini hedef DNA dizisini çentikler ve pegRNA'nın RT şablon kısmının ters transkripsiyonunu başlatmak (prime) için kullanılabilen bir 3'-hidroksil grubunu açığa çıkarır. Bu, iki DNA kanadı içeren dallanmış bir ara ürünle sonuçlanır: yeni sentezlenmiş (düzenlenmiş) diziyi içeren bir 3' kanatçık ve vazgeçilebilir, düzenlenmemiş DNA dizisini içeren bir 5' kanatçık. 5' kanat daha sonra yapıya özgü endonükleazlar veya 5' eksonükleazlar tarafından bölünür. Bu işlem 3' flep ligasyonuna izin verir ve bir düzenlenmiş iplikten ve bir düzenlenmemiş iplikten oluşan bir heterodubleks DNA oluşturur. Yeniden tavlanmış çift sarmallı DNA, düzenlemenin gerçekleştiği yerde nükleotit uyumsuzlukları içerir. Uyumsuzlukları düzeltmek için hücreler, iki olası sonuçla birlikte içsel uyumsuzluk onarım mekanizmasından yararlanır: (i) düzenlenen dizideki bilgiler, düzenlemeyi kalıcı olarak yükleyerek tamamlayıcı diziye kopyalanır; (ii) orijinal nükleotidler, düzenleme hariç, düzenlenen diziye yeniden dahil edilir.

Gelişme Süreci

Bu teknolojinin geliştirilmesi sırasında, etkinliğini artırmak için bileşenlerde çeşitli değişiklikler yapılmaktadır.

Prime editör 1

İlk sistemde, vahşi tip bir Moloney Murin Lösemi Virüsü (M-MLV) ters transkriptazı, Cas9 H840A nickaz C-terminaline kaynaştırıldı. Algılanabilir düzenleme verimlilikleri gözlemlendi

Prime editör 2

DNA-RNA afinitesini, enzim işlenebilirliğini ve termostabiliteyi arttırmak için, M-MLV ters transkriptazına beş amino asit ikamesi dahil edildi. Mutant M-MLV RT daha sonra PE1'e dahil edilerek (Cas9 (H840A)-M-MLV RT(D200N/L603W/T330P/T306K/W313F)) elde edildi. PE1'e göre verimlilik artışı gözlemlendi.

Prime editör 3

Artan etkinliğine rağmen, PE2 tarafından eklenen düzenleme, düzenlenen ipliğin DNA uyumsuzluğu onarımı nedeniyle yine de kaldırılabilir. DNA heterodupleks çözünürlüğü sırasında bu sorunu önlemek için ek bir tek kılavuz RNA (sgRNA) eklenir. Bu sgRNA, orijinal alel ile değil, pegRNA tarafından sunulan düzenlenmiş diziyle eşleşecek şekilde tasarlanmıştır. Füzyon proteininin Cas9 nickaz kısmını, orijinal nickin karşısında, yakındaki bir bölgede düzenlenmemiş ipliği çentiklemek için yönlendirir. Düzenlenmemiş ipliğin çentiklenmesi, hücrenin doğal onarım sisteminin, düzenlenmiş iplikteki bilgileri tamamlayıcı ipliğe kopyalamasına ve düzenlemeyi kalıcı olarak yüklemesine neden olur.

Şekil 3: Birinci sınıf düzenleme için PE3 sistemi

Etkileri

Asal düzenlemenin verimliliğini artırmak için ek araştırmalar gerekmesine rağmen, teknoloji, diğer gen düzenleme araçlarına göre umut verici bilimsel gelişmeler sunuyor. Birincil düzenleme teknolojisi, eklemeleri, delesyonları ve nükleotid ikamelerini onarabildiğinden, genetik hastalıklara neden olan patojenik alellerin büyük çoğunluğunu düzeltme potansiyeline sahiptir.

Avantajlar

Birincil düzenleme aracı, geleneksel gen düzenleme teknolojilerine göre avantajlar sunar. CRISPR/Cas9 düzenlemeleri, DNA kırıklarını düzeltmek için homolog olmayan uç birleştirmeye (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarıma (HDR) dayanırken, ana düzenleme sistemi DNA uyumsuzluğu onarımını kullanır. NHEJ ve HDR gibi DNA onarım mekanizmalarının, doğru düzenlemeyi taşıyan hücrelerin alınmasını zorlaştıran istenmeyen, rastgele eklemeler veya silmeler (INDEL'ler) ürettiği göz önüne alındığında, bu teknolojinin önemli bir özelliğidir.

Asal sistem, baz düzenleyiciler gibi diğer düzenleme araçlarında gözlemlenen çift sarmallı DNA kopmaları yerine tek sarmallı DNA kopmalarını sunar. Toplu olarak, temel düzenleme ve birincil düzenleme, hedeflenen geçiş mutasyonları yapmak için tamamlayıcı güçlü ve zayıf yönler sunar. Temel düzenleyiciler, istenen düzenleme bir geçiş noktası mutasyonuysa ve hedef bölgeden kabaca 15 bazda bir PAM dizisi varsa, daha yüksek düzenleme verimliliği ve daha az INDEL yan ürünü sunar. Ancak, birincil düzenleme teknolojisi, bir nükleotid dizisini hedeflemek için tam olarak konumlandırılmış bir PAM dizisi gerektirdiğinden, daha fazla esneklik ve düzenleme hassasiyeti sunar. Dikkat çekici bir şekilde, asal editörler, hedef diziye her türlü ikame, geçiş ve transversiyonun eklenmesine izin verir.

Asal sistem üç ayrı DNA bağlama olayı içerdiğinden ((i) kılavuz dizi ve hedef DNA arasında, (ii) primer bağlama bölgesi ve hedef DNA arasında ve (iii) çentikli DNA zincirinin 3' ucu ile pegRNA), CRISPR/Cas9'dan daha az istenmeyen hedef dışı etkiye sahip olduğu öne sürülmüştür.

Sınırlamalar

Genetik bileşeni olan hastalıkların tedavisine gen düzenleme yöntemlerinin uygulanmasına büyük ilgi vardır. Ancak, bu yaklaşımla ilişkili birden fazla zorluk vardır. Etkili bir tedavi, çok sayıda hedef hücrenin düzenlenmesini gerektirecek ve bu da etkili bir dağıtım yöntemi ve yüksek düzeyde doku özgüllüğü gerektirecektir.

2019 itibariyle, birincil düzenleme nispeten küçük genetik değişiklikler için umut verici görünüyor, ancak teknolojinin hedeflenen eklemeler ve silmeler gibi daha büyük değişiklikler yapmada etkili olup olmadığını değerlendirmek için daha fazla araştırma yapılması gerekiyor. Daha büyük genetik değişiklikler, pegRNA'nın hedef hücrelere verimli bir şekilde iletilmesini engelleyebilecek daha uzun bir RT şablonu gerektirecektir. Ayrıca, uzun bir RT şablonu içeren bir pegRNA, hücresel enzimlerin neden olduğu hasara karşı savunmasız hale gelebilir.

Genel olarak, insan hastalıklarındaki patojenik alelleri düzeltmek için birincil düzenlemenin kullanılabilmesi için çok fazla araştırmaya ihtiyaç duyulacaktır.

Teslimat Yöntemi

Birincil düzenleme için kullanılan temel düzenleyiciler, hem bir proteinin hem de RNA molekülünün canlı hücrelere verilmesini gerektirir. Canlı organizmalara eksojen gen düzenleme teknolojilerinin dahil edilmesi önemli bir zorluktur. Bir temel düzenleyiciyi hayvanlara ve bitkilere sokmanın olası bir yolu, temel düzenleyiciyi viral bir kapsid halinde paketlemek olacaktır. Hedef organizma daha sonra virüs tarafından in vivo baz düzenleyiciyi sentezlemek için dönüştürülebilir. Lentivirüs gibi yaygın laboratuvar transdüksiyon vektörleri insanlarda bağışıklık tepkilerine neden olur, bu nedenle önerilen insan tedavileri genellikle adeno-ilişkili virüs (AAV) etrafında merkezlenir, çünkü AAV enfeksiyonları büyük ölçüde asemptomatiktir. Ne yazık ki, AAV vektörlerinin etkin paketleme kapasitesi küçüktür, ters çevrilmiş terminal tekrarları hariç yaklaşık 4.4 kb'dir. Karşılaştırma olarak, bir SpCas9-ters transkriptaz füzyon proteini 6.3 kb'dir, bu, ilgilenilen siteyi hedeflemek ve hazırlamak için gerekli olan uzatılmış kılavuz RNA'yı bile hesaba katmaz.

Kaynak

1-Anzalone, Andrew V.; Randolph, Peyton B.; Davis, Jessie R.; Sousa, Alexander A.; Koblan, Luke W.; Levy, Jonathan M.; Chen, Peter J.; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A.; Raguram, Aditya; Liu, David R. (21 October 2019). "Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA". Nature. 576 (7785): 149–157.

2-Ran, F.Ann; Hsu, Patrick D.; Lin, Chie-Yu; Gootenberg, Jonathan S.; Konermann, Silvana; Trevino, Alexandro E.; Scott, David A.; Inoue, Azusa; Matoba, Shogo; Zhang, Yi; Zhang, Feng (Eylül 2013). "Geliştirilmiş Genom Düzenleme Özgüllüğü için RNA Güdümlü CRISPR Cas9 ile Çift Nickleme". Hücre. 154 (6): 1380-1389.