Hücre Kültürü

 Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü koşullar altında, genellikle doğal ortamlarının dışında büyütüldüğü süreçtir. İlgili hücreler canlı dokudan izole edildikten sonra, dikkatlice kontrol edilen koşullar altında muhafaza edilebilirler. Bu koşullar her hücre tipine göre değişir, ancak genellikle temel besinleri (amino asitler, karbonhidratlar, vitaminler, mineraller), büyüme faktörleri, hormonlar ve gazları (CO2, O2) sağlayan bir substrat veya ortam içeren uygun bir kaptan oluşur ve fizyo-kimyasal ortamı düzenler (pH tamponu, ozmotik basınç, sıcaklık). Çoğu hücre bir yüzey veya yapay bir substrat (yapışkan veya tek katmanlı kültür) gerektirirken, diğerleri kültür ortamında (süspansiyon kültürü) serbest yüzerek büyütülebilir. Çoğu hücrenin ömrü genetik olarak belirlenir, ancak bazı hücre kültürü hücreleri, optimal koşullar sağlandığında süresiz olarak çoğalacak olan ölümsüz hücrelere “dönüştürüldü”.

Uygulamada, "hücre kültürü" terimi, bitki doku kültürü, mantar kültürü ve mikrobiyolojik kültür gibi hücreleri de büyüten diğer kültür türlerinin aksine, çok hücreli ökaryotlardan, özellikle hayvan hücrelerinden türetilen hücrelerin kültürlenmesini ifade eder. mikroplar). Hücre kültürünün tarihsel gelişimi ve yöntemleri, doku kültürü ve organ kültürü ile yakından ilişkilidir. Viral kültür, virüsler için konakçı olarak hücrelerle de ilişkilidir.

Canlı hücre dizilerini (tek bir hücreden türeyen ve aynı genetik yapıya sahip bir hücre popülasyonu) orijinal doku kaynaklarından ayrı olarak muhafaza etmeye yönelik laboratuvar tekniği, 20. yüzyılın ortalarında daha sağlam hale geldi.

Memeli Hücre Kültüründe kavramlar

Hücrelerin izolasyonu

Hücreler, dokulardan ex vivo kültür için çeşitli yollarla izole edilebilir. Hücreler kandan kolaylıkla arındırılabilir; bununla birlikte, kültürde yalnızca beyaz hücreler üreme yeteneğine sahiptir. Hücreler, hücreleri süspansiyon haline getirmek için dokuyu çalkalamadan önce kollajenaz, tripsin veya pronaz gibi enzimler kullanılarak hücre dışı matrisin sindirilmesiyle katı dokulardan izole edilebilir. Alternatif olarak, doku parçaları büyüme ortamına yerleştirilebilir ve büyüyen hücreler kültür için kullanılabilir. Bu yöntem eksplant kültürü olarak bilinir.

Doğrudan bir özneden kültürlenen hücreler, birincil hücreler olarak bilinir. Tümörlerden türetilenler dışında, çoğu birincil hücre kültürü sınırlı bir ömre sahiptir.

Yerleşik veya ölümsüzleştirilmiş bir hücre çizgisi, telomeraz geninin yapay ifadesi gibi rastgele mutasyon veya kasıtlı modifikasyon yoluyla süresiz olarak çoğalma yeteneğini kazanmıştır. Çok sayıda hücre çizgisi, belirli hücre tiplerinin temsilcisi olarak iyi bir şekilde oluşturulmuştur.

Hücrelerin Kültürde Tutulması

İzole edilmiş birincil hücrelerin çoğu için, yaşlanma sürecinden geçerler ve belirli sayıda popülasyon iki katına çıktıktan sonra bölünmeyi durdururlar ve genellikle canlılıklarını korurlar (Hayflick limiti olarak tanımlanır).

Sıcaklık ve gaz karışımının yanı sıra, kültür sistemlerinde en çok değişen faktör hücre büyüme ortamıdır. Büyüme ortamı için tarifler pH, glikoz konsantrasyonu, büyüme faktörleri ve diğer besinlerin varlığına göre değişebilir. Ortamı desteklemek için kullanılan büyüme faktörleri, genellikle fetal sığır serumu (FBS), sığır buzağı serumu, at serumu ve domuz serumu gibi hayvan kanının serumundan elde edilir. Bu kandan türetilen bileşenlerin bir komplikasyonu, özellikle tıbbi biyoteknoloji uygulamalarında kültürün virüsler veya prionlarla kontaminasyon potansiyelidir. Mevcut uygulama, mümkün olan her yerde bu bileşenlerin kullanımını en aza indirmek veya ortadan kaldırmak ve insan trombosit lizatını (hPL) kullanmaktır. Bu, FBS'yi insan hücreleriyle kullanırken türler arası kontaminasyon endişesini ortadan kaldırır. hPL, FBS veya diğer hayvan serumları için doğrudan bir ikame olarak güvenli ve güvenilir bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Ek olarak, herhangi bir serum izini (insan veya hayvan) ortadan kaldırmak için kimyasal olarak tanımlanmış ortamlar kullanılabilir, ancak bu her zaman farklı hücre tipleri ile gerçekleştirilemez. Alternatif stratejiler, hayvan kanının Amerika Birleşik Devletleri, Avustralya ve Yeni Zelanda gibi minimum BSE/TSE riski olan ülkelerden alınmasını ve hücre kültürü için tam hayvan serumu yerine serumdan elde edilen saflaştırılmış besin konsantrelerinin kullanılmasını içerir.

Kaplama yoğunluğu (kültür ortamı hacmi başına hücre sayısı), bazı hücre tipleri için kritik bir rol oynar. Örneğin, daha düşük bir kaplama yoğunluğu, granüloza hücrelerinin östrojen üretimi sergilemesine neden olurken, daha yüksek bir kaplama yoğunluğu, onların progesteron üreten teka lutein hücreleri olarak görünmesini sağlar.

Hücreler, süspansiyon veya yapışık kültürler içinde büyütülebilir. Bazı hücreler, kan dolaşımında bulunan hücreler gibi, bir yüzeye bağlanmadan doğal olarak süspansiyon halinde yaşarlar. Yapışkan koşulların izin verdiğinden daha yüksek bir yoğunluğa büyütülebilmeleri için süspansiyon kültürlerinde hayatta kalabilmek için modifiye edilmiş hücre hatları da vardır. Yapışkan hücreler, yapışma özelliklerini artırmak ve büyüme ve farklılaşma için gereken diğer sinyalleri sağlamak için hücre dışı matris (kollajen ve laminin gibi) bileşenleri ile kaplanabilen doku kültürü plastiği veya mikro taşıyıcı gibi bir yüzey gerektirir. Katı dokulardan türetilen hücrelerin çoğu yapışıktır. Yapışkan kültürün başka bir türü, iki boyutlu kültür tabaklarının aksine üç boyutlu (3-D) bir ortamda hücrelerin büyümesini içeren organotipik kültürdür. Bu 3D kültür sistemi, biyokimyasal ve fizyolojik olarak in vivo dokuya daha benzer, ancak birçok faktör (örn. difüzyon) nedeniyle bakımı teknik olarak zordur.

Hücre hattı çapraz kontaminasyonu

Hücre hattı çapraz kontaminasyonu, kültürlenmiş hücrelerle çalışan bilim adamları için bir sorun olabilir. Çalışmalar, zamanın %15-20'sinde, deneylerde kullanılan hücrelerin yanlış tanımlandığını veya başka bir hücre hattıyla kontamine olduğunu göstermektedir. NCI-60 panelinden rutin olarak kullanılan hatlarda bile hücre hattı çapraz kontaminasyonu ile ilgili sorunlar tespit edilmiştir. ilaç tarama çalışmaları için. Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC), Avrupa Hücre Kültürleri Koleksiyonu (ECACC) ve Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu (DSMZ) dahil olmak üzere büyük hücre hattı depoları, araştırmacılar tarafından yanlış tanımlanan hücre hattı gönderileri aldı. Bu tür bir kontaminasyon, hücre kültürü hatları kullanılarak üretilen araştırmaların kalitesi için bir sorun teşkil etmektedir ve büyük depolar artık tüm hücre hattı gönderimlerinin kimliğini doğrulamaktadır. ATCC, hücre hatlarının kimliğini doğrulamak için kısa tandem tekrar (STR) DNA parmak izini kullanır.

Bu hücre hattı çapraz kontaminasyonu sorununu ele almak için, araştırmacıların hücre hattının kimliğini belirlemek için erken bir geçişte hücre hatlarının kimliğini doğrulamaları teşvik edilir. Kimlik doğrulama, hücre dizisi stokları dondurulmadan önce, aktif kültürleme sırasında her iki ayda bir ve hücre dizileri kullanılarak oluşturulan araştırma verilerinin herhangi bir yayınlanmasından önce tekrarlanmalıdır. Hücre çizgilerini tanımlamak için izoenzim analizi, insan lenfosit antijeni (HLA) tiplemesi, kromozomal analiz, karyotipleme, morfoloji ve STR analizi dahil olmak üzere birçok yöntem kullanılır.

Diğer teknik sorunlar

Hücreler genellikle kültürde bölünmeye devam ettikçe, genellikle mevcut alanı veya hacmi doldurmak için büyürler. Bu, birkaç sorun oluşturabilir:

1-Büyüme ortamında besin tükenmesi

2-Büyüme ortamının pH'ındaki değişiklikler

3-Apoptotik/nekrotik (ölü) hücrelerin birikmesi

4-Hücreden hücreye temas, hücre döngüsü durmasını uyarabilir, bu da temas inhibisyonu olarak bilinen hücrelerin bölünmeyi durdurmasına neden olabilir.

5-Hücreden hücreye temas, hücresel farklılaşmayı uyarabilir.

6-Genetik ve epigenetik değişiklikler, potansiyel olarak anormal, kültüre uyarlanmış hücrelerin aşırı büyümesine yol açan değiştirilmiş hücrelerin doğal seçimi ile azalmış farklılaşma ve artan çoğalma kapasitesi.

Kültür ortamının seçimi, besin bileşimi ve konsantrasyonlarındaki farklılıklar nedeniyle hücre kültürü deneylerinden elde edilen bulguların fizyolojik uygunluğunu etkileyebilir. Yakın zamanda CRISPR ve RNAi gen susturma ekranları ve kanser hücre hatlarının metabolik profili için oluşturulan veri kümelerinde sistematik bir önyargı gösterildi. Besinlerin fizyolojik seviyelerini daha iyi temsil eden bir büyüme ortamının kullanılması, in vitro çalışmaların fizyolojik ilişkisini iyileştirebilir ve son zamanlarda Plasmax ve Human Plasma Like Medium (HPLM) gibi ortam türleri geliştirilmiştir.

Kültürlenmiş Hücrelerin Manipülasyonu

Kültür hücreleri üzerinde gerçekleştirilen yaygın manipülasyonlar arasında ortam değişiklikleri, geçiş hücreleri ve transfekte edici hücreler bulunur. Bunlar genellikle aseptik tekniğe dayanan doku kültürü yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Aseptik teknik, bakteri, maya veya diğer hücre hatları ile kontaminasyonu önlemeyi amaçlar. Manipülasyonlar tipik olarak bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış kabininde kontamine olan mikroorganizmaları dışarıda bırakmak için gerçekleştirilir. Büyüme ortamına antibiyotikler (örn. penisilin ve streptomisin) ve antifungaller (örn. amfoterisin B ve Antibiyotik-Antimikotik solüsyon) da eklenebilir.

Hücreler metabolik süreçlerden geçerken asit üretilir ve pH düşer. Besin tükenmesini ölçmek için genellikle ortama bir pH göstergesi eklenir.

Medyum değişiklikleri

Yapışkan kültürler durumunda, ortam doğrudan aspirasyonla çıkarılabilir ve ardından değiştirilebilir. Yapışmayan kültürlerdeki ortam değişiklikleri, kültürün santrifüj edilmesini ve hücrelerin taze ortamda yeniden süspanse edilmesini içerir.

Geçiş hücreleri

Pasajlama (alt kültür veya bölme hücreleri olarak da bilinir), az sayıda hücrenin yeni bir kaba aktarılmasını içerir. Hücreler, uzun süreli yüksek hücre yoğunluğu ile ilişkili yaşlanmayı önlediğinden, düzenli olarak bölünürlerse daha uzun süre kültürlenebilir. Süspansiyon kültürleri, daha büyük hacimli taze ortam içinde seyreltilmiş birkaç hücre içeren az miktarda kültür ile kolayca geçirilir. Yapışkan kültürler için öncelikle hücrelerin ayrılması gerekir; bu genellikle bir tripsin-EDTA karışımı ile yapılır; bununla birlikte, artık bu amaç için başka enzim karışımları da mevcuttur. Daha sonra yeni bir kültürü tohumlamak için az sayıda ayrılmış hücre kullanılabilir. RAW hücreler gibi bazı hücre kültürleri, kauçuk kazıyıcılarla kaplarının yüzeyinden mekanik olarak kazınır.

Transfeksiyon ve transdüksiyon

Hücreleri manipüle etmek için başka bir yaygın yöntem, transfeksiyon yoluyla yabancı DNA'nın sokulmasını içerir. Bu genellikle hücrelerin ilgilenilen bir geni ifade etmesine neden olmak için yapılır. Daha yakın zamanlarda, RNAi yapılarının transfeksiyonu, belirli bir gen/proteinin ekspresyonunu bastırmak için uygun bir mekanizma olarak gerçekleştirilmiştir. DNA ayrıca transdüksiyon, enfeksiyon veya transformasyon olarak adlandırılan yöntemlerle virüsler kullanılarak hücrelere yerleştirilebilir. Parazit ajanlar olarak virüsler, normal üreme sürecinin bir parçası olduğu için DNA'yı hücrelere sokmak için çok uygundur.

Yerleşik İnsan Hücre Hatları

uzun yaşayabilecekleri ve daha sonra kazançlı tıbbi tedavilerin keşfinde kullanılabilecekleri için biyoetikte biraz tartışmalı olmuştur. Bu alandaki öncü kararda, Kaliforniya Yüksek Mahkemesi, California Üniversitesi'nden Moore v. Regents davasında, insan hastaların kendi rızaları ile alınan organlardan elde edilen hücre dizileri üzerinde hiçbir mülkiyet hakkının bulunmadığına karar verdi.

Şekil 1: Kültürlenmiş HeLa hücreleri, çekirdeklerini maviye çeviren Hoechst ile boyanmıştır ve bu hücrelerin kaynaklandığı rahim ağzı kanserinden ölen Henrietta Lacks'in soyundan gelen en eski insan hücre dizilerinden biridir.

Hibridoma

Normal hücreleri ölümsüzleştirilmiş bir hücre çizgisiyle kaynaştırmak mümkündür. Bu yöntem monoklonal antikorlar üretmek için kullanılır. Kısaca, bağışıklık kazandırılmış bir hayvanın dalağından (veya muhtemelen kanından) izole edilen lenfositler, birincil lenfositin antikor özgüllüğüne ve miyelomun ölümsüzlüğüne sahip bir hibridom üretmek için ölümsüz bir miyelom hücre dizisi (B hücre dizisi) ile birleştirilir. Seçici büyüme ortamı (HA veya HAT), kaynaşmamış miyelom hücrelerine karşı seçim yapmak için kullanılır; primer lenfositler kültürde hızla ölür ve sadece kaynaşmış hücreler hayatta kalır. Bunlar, genellikle tek klonlama ile başlamak üzere ve sonrasında havuzlarda gerekli antikor üretimi için taranır.

Hücre Suşları

Bir hücre suşu, tanımlanması gereken spesifik özelliklere veya karakteristiklere sahip hücrelerin seçilmesi veya klonlanmasıyla bir birincil kültürden veya bir hücre çizgisinden türetilir. Hücre suşları, kültüre adapte edilmiş ancak hücre çizgilerinin aksine sonlu bir bölünme potansiyeline sahip hücrelerdir. Ölümsüzleştirilmemiş hücreler, 40 ila 60 nüfus ikiye katlanmasından sonra bölünmeyi durdurur ve bundan sonra çoğalma yeteneklerini kaybederler (genetik olarak belirlenmiş bir olay, yaşlanma olarak bilinir)

Hücre Kültürü Lab Videosu : https://youtu.be/Cc1wYIcbqrM