ÖKARYOTİK DNA İZOLASYONU
Berna Türkmen, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Haliç Üniversitesi
DNA izolasyonu, genetik bilginin bulunduğu konumdan
uzaklaştırılarak saf bir şekilde etme edilmesi yöntemidir. DNA izolasyonu ile
birçok moleküler genetik çalışmalarda, hastalık teşhislerinde, parmak izi
teşhisinde ve daha birçok alanda kullanılmaktadır.
DNA
izolasyonu genel prosedür olarak 3 aşamadan oluşmaktadır:
1)
Hücre
Lizisi: Bu aşamadaki amaç ile hücre
ve çekirdeği mekanik yöntemler (havan/havaneli vs.) ya da enzimatik yöntemler (Proteinaz K, Deterjan )
kullanılarak parçalamaktır.
2)
DNA’nın
Çöktürülmesi: Lizis aşaması bittikten
sonrasında hücre parçalanan komponentlerden ayrılması gerekir. Bu aşamada
DNA’yı çöktürerek bir sonraki saflaştırma aşamasına getirmektir. DNA’yı çötürme
işlemi Na+ iyonları DNA’nın negatif yükünü nötralize eder ve DNA’yı suda daha
az çözünür hale getirerek alkol ilave edilir. DNA alkolde çözünememesinden
ötürü çöktürme işlemi sağlanır.
3)
DNA’nın
Saflaştırılması: DNA çöktürme
aşamasından sonra DNA’nın hücresel komponentlerden ayrılması gerekir ve bunun
için alkolde durulama işlemine tabi tutulması gerekebilir. DNA saflaştırma
işlemi tamamlandıktan sonra kısa süreli saklama gerektiğinde +4°C’de saklanır.
Uzun süreli saklama gerektiğinde elde edilen saf DNA -20°C’de saklanır.
İzole
aşamalarında kullanılan birçok kimyasal bulunur. EDTA, DNaz aktivitesini yok
eder ve pH yüksek bir duruma ulaştığunda inhibe eder. Tris, DNA ve RNA
saklanması gerektiğinde pH’ın sabitlenmesine yardımcı olur ve saklanmaya uygun
duruma getirir. SDS, hücre lizisi enzimatik yöntemle parçalanma gerektiğinde
kullanılan anyonik bir deterjandır ve ayrıca bazı proteinlerin denatürasyonunu
da sağlar. Sükroz, hücre lizisi aşamasında parçalanmayı sağlamak için osmotik
basınç oluşturur. 5M NaCl, proteinlerin nükleik asitlerden ayrılmasını sağlar.
Etanol, protein/DNA çökelmesini su moleküllerine bağlanarak ortamdan suyun
çekilmesiyle sağlar.
İzole
edilen DNA’nın miktar tayini için absorbsiyon temeline dayalı spektral yöntem
kullanılır. Spektrofotometre cihazı ile DNA’nın 260 nm, 280nm, 230nm dalga
boylarında max. absorbsiyon ölçümlerine bakılır. Nükleotidler 260 nm dalga
boyunda heterosiklik dalgaları max. absorbans gösterir. Bundan ötürü 260 nm’de
ölçülen absorbans değerleri ilee ng düzeyinde miktar analizi yapılır.
Proteinlerde
UV’yi absorbe ettiklerinden spektrofotometre cihazı ile ile miktarları
belirlenebilir. 230 nm ve 280 nm max. absorbans değerlerine bakılır. Proteinler
230 nm’nin tepe noktası peptid bağlarından kaynaklı absorbans gösterir. 280 nm
dalga boyundaki tepe noktası aromatik amino asitlerin halkalarında oluşan
absorbanstan kaynaklıdır.
DNA
izolasyonunda DNA saflığı önemli rol oynar. Bundan ötürü DNA saflığı belirlemek
için; birincil ölçüm olarak A260/A280 oranı kullanılır.
Beklenen oran 1.8’dir. 1.8’den daha düşük sonuç gözlendiğinde protein
kontaminasyonu etkisi düşünülür. İkincil ölçüm olarak; nükleik asitlerin
saflığının belirlenmesinde A260 / A230 oranına bakılır.
İstenilen 2.0-2.2 aralığıdır. Bu aralıktan düşük sonuç gözlendiğinde
karbonhidrat bakiyesi, guanidin kalıntısı etkisi olabileceği düşünülebilir.
DNA
sağlamlığına bakmak için ise agaroz jel elektroforez işlemi yapılır. Agaroz jel
elektroforezi orta ve büyük boyutlu nükleik asitlerin ayrılmasından en çok
kullanılan yöntemdir. Elektroforez işlemi yapılırken marker kullanılır. Marker
ile standart nükleik asitlerin fragmentlerinin yürütülmesiyle analiz edilen
moleküllerin ağırlıkları belirlenir. Yükleme tamponu, DNA fragmentine eklenerek
örneğin yoğunluğu arttırılır ve elektroforezin ilerlemesi takip edilir. DNA’nın
görüntülenmesi EtBr boyama yapılarak belirlenir. EtBr floresan bir boya olup
DNA halkalarının arasına girerek ışıma yapar (Şekil 2).
Şekil 1: Agaroz
jel elektroforez sistemi ve moleküllerin hareketleri sonucu jelde oluşan
bantlar
Şekil 2: EtBr
boyasının DNA halkaları arasındaki şematik görüntüsü
Referanslar:
1) 1. Koh CM. Isolation of genomic DNA from mammalian
cells. Methods Enzymol. 2013;529:161-9. doi:
10.1016/B978-0-12-418687-3.00013-6. PMID: 24011044.
2)2.Gadau J. (2009). DNA isolation from ants. Cold
Spring Harbor protocols, 2009(7), pdb.prot5245.
3)3. Kalendar, R., Boronnikova, S., & Seppänen,
M. (2021). Isolation and Purification of DNA from Complicated Biological
Samples. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2222,
57–67. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0997-2_3
4) 4. Kavsaoğlu, A. R., & Mersinkaya, İ. Python
İle Mini Jel Elektroforez Kontrol Yazılımı Ve Sistem Tasarımı. Gazi
Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi Part C: Tasarım ve Teknoloji, 7(4),
969-984.
Yorumlar
Yorum Gönder