ÖKARYOTİK DNA İZOLASYONU

 

Berna Türkmen, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Haliç Üniversitesi

DNA izolasyonu, genetik bilginin bulunduğu konumdan uzaklaştırılarak saf bir şekilde etme edilmesi yöntemidir. DNA izolasyonu ile birçok moleküler genetik çalışmalarda, hastalık teşhislerinde, parmak izi teşhisinde ve daha birçok alanda kullanılmaktadır.

   DNA izolasyonu genel prosedür olarak 3 aşamadan oluşmaktadır:

1)      Hücre Lizisi: Bu aşamadaki amaç ile hücre ve çekirdeği mekanik yöntemler (havan/havaneli vs.) ya da enzimatik yöntemler (Proteinaz K, Deterjan ) kullanılarak parçalamaktır.

2)      DNA’nın Çöktürülmesi: Lizis aşaması bittikten sonrasında hücre parçalanan komponentlerden ayrılması gerekir. Bu aşamada DNA’yı çöktürerek bir sonraki saflaştırma aşamasına getirmektir. DNA’yı çötürme işlemi Na+ iyonları DNA’nın negatif yükünü nötralize eder ve DNA’yı suda daha az çözünür hale getirerek alkol ilave edilir. DNA alkolde çözünememesinden ötürü çöktürme işlemi sağlanır.

3)      DNA’nın Saflaştırılması: DNA çöktürme aşamasından sonra DNA’nın hücresel komponentlerden ayrılması gerekir ve bunun için alkolde durulama işlemine tabi tutulması gerekebilir. DNA saflaştırma işlemi tamamlandıktan sonra kısa süreli saklama gerektiğinde +4°C’de saklanır. Uzun süreli saklama gerektiğinde elde edilen saf  DNA -20°C’de saklanır.

      

      İzole aşamalarında kullanılan birçok kimyasal bulunur. EDTA, DNaz aktivitesini yok eder ve pH yüksek bir duruma ulaştığunda inhibe eder. Tris, DNA ve RNA saklanması gerektiğinde pH’ın sabitlenmesine yardımcı olur ve saklanmaya uygun duruma getirir. SDS, hücre lizisi enzimatik yöntemle parçalanma gerektiğinde kullanılan anyonik bir deterjandır ve ayrıca bazı proteinlerin denatürasyonunu da sağlar. Sükroz, hücre lizisi aşamasında parçalanmayı sağlamak için osmotik basınç oluşturur. 5M NaCl, proteinlerin nükleik asitlerden ayrılmasını sağlar. Etanol, protein/DNA çökelmesini su moleküllerine bağlanarak ortamdan suyun çekilmesiyle sağlar.

       

    İzole edilen DNA’nın miktar tayini için absorbsiyon temeline dayalı spektral yöntem kullanılır. Spektrofotometre cihazı ile DNA’nın 260 nm, 280nm, 230nm dalga boylarında max. absorbsiyon ölçümlerine bakılır. Nükleotidler 260 nm dalga boyunda heterosiklik dalgaları max. absorbans gösterir. Bundan ötürü 260 nm’de ölçülen absorbans değerleri ilee ng düzeyinde miktar analizi yapılır.

    

    Proteinlerde UV’yi absorbe ettiklerinden spektrofotometre cihazı ile ile miktarları belirlenebilir. 230 nm ve 280 nm max. absorbans değerlerine bakılır. Proteinler 230 nm’nin tepe noktası peptid bağlarından kaynaklı absorbans gösterir. 280 nm dalga boyundaki tepe noktası aromatik amino asitlerin halkalarında oluşan absorbanstan kaynaklıdır.

   

   DNA izolasyonunda DNA saflığı önemli rol oynar. Bundan ötürü DNA saflığı belirlemek için; birincil ölçüm olarak A₂₆₀/A₂₈₀ oranı kullanılır. Beklenen oran 1.8’dir. 1.8’den daha düşük sonuç gözlendiğinde protein kontaminasyonu etkisi düşünülür. İkincil ölçüm olarak; nükleik asitlerin saflığının belirlenmesinde A₂₆₀ / A₂₃₀ oranına bakılır. İstenilen 2.0-2.2 aralığıdır. Bu aralıktan düşük sonuç gözlendiğinde karbonhidrat bakiyesi, guanidin kalıntısı etkisi olabileceği düşünülebilir.

 

     DNA sağlamlığına bakmak için ise agaroz jel elektroforez işlemi yapılır. Agaroz jel elektroforezi orta ve büyük boyutlu nükleik asitlerin ayrılmasından en çok kullanılan yöntemdir. Elektroforez işlemi yapılırken marker kullanılır. Marker ile standart nükleik asitlerin fragmentlerinin yürütülmesiyle analiz edilen moleküllerin ağırlıkları belirlenir. Yükleme tamponu, DNA fragmentine eklenerek örneğin yoğunluğu arttırılır ve elektroforezin ilerlemesi takip edilir. DNA’nın görüntülenmesi EtBr boyama yapılarak belirlenir. EtBr floresan bir boya olup DNA halkalarının arasına girerek ışıma yapar (Şekil 2). 

Şekil 1: Agaroz jel elektroforez sistemi ve moleküllerin hareketleri sonucu jelde oluşan bantlar

Şekil 2: EtBr boyasının DNA halkaları arasındaki şematik görüntüsü

 

Referanslar:

1) 1. Koh CM. Isolation of genomic DNA from mammalian cells. Methods Enzymol. 2013;529:161-9. doi: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00013-6. PMID: 24011044.

2)2.Gadau J. (2009). DNA isolation from ants. Cold Spring Harbor protocols, 2009(7), pdb.prot5245.

3)3.  Kalendar, R., Boronnikova, S., & Seppänen, M. (2021). Isolation and Purification of DNA from Complicated Biological Samples. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2222, 57–67. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0997-2_3

4) 4. Kavsaoğlu, A. R., & Mersinkaya, İ. Python İle Mini Jel Elektroforez Kontrol Yazılımı Ve Sistem Tasarımı. Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi Part C: Tasarım ve Teknoloji, 7(4), 969-984.