KOMPETAN HÜCRE HAZIRLANMASI, PZR ÜRÜNÜNÜN VEKTÖRE KLONLANMASI

 

Berna TÜRKMEN,  Moleküler Biyoloji ve Genetik, Haliç Üniversitesi

       Kompetan hücre,  transformasyon yapabilme  yetisine  sahip olan  hücreye denir. Transformasyon ise  örneğin bakteriyel transformasyona bakıldığında  çevrede yabancı DNA molekülleri  düşük konsantrasyonda  bulunduğunda  bakteri hücreleri tarafından  hücrenin  iç kısmına  alındığı bir süreçtir. 

 Transformasyon iki farklı şekilde gerçekleştirilir:

1)      Isı Şokuyla Transformasyon: CaCl₂ kullanılarak kompetan hücreler hazırlanır. Böylelikle  hücre membranın  geçirgenliğinde bir artış gözlemlenir.   Kompetanlık kimyasal bir şekilde arttırılmak istendiğinde katyonlar ( Mn⁺², K⁺, Rb⁺)   kullanılabilir. Lipopolisakkarit tabaka  bakteri hücre duvarında bulunur.  Bu  tabakadaki  negatif yüklü  fosfat grupları  ile  DNA molekülünde bulunan fosfat grupları arasında  bir katyon iletişimi  başlatmak  asıl amaçtır. CaCl₂  soğuk muamele edildiğinde DNA molekülünün  bakteri hücre duvarına  yerleşimini sağlar.  Isı şoku ile ise  hücre membranlarının üzerinde bulunan porların kısa bir süre açık bırakılması sağlanarak  DNA molekülünün bakteri hücresine girmesi sağlanır.

2)      Elektroporasyon Yöntemi İle Transformasyon: Bu yöntemde  elektroporatör  cihazı kullanılır.  bu cihaz ile  kompetan hücreye,  DNA moleküllerine  elektrik akımı verilir  ve bu akımla beraber  hücre membranında porların  açılımı sağlanır.  Bu por açılımı sayesinde  hücre içerisine transfer olur. 

        Moleküler klonlama yapılırken bu bahsedilen bakteriyel transformasyon önemli bir aşamadır.  Rekombinant plazmit hedef  DNA içerir  ve bakteri hücresine  transforme  işlemi gerçekleşir.  Böylelikle bir analiz yapılmak istendiğinde rekombinant DNA dizisinin  transforme işlemi gerçekleştirilen konak hücre ile istenilen miktarda çoğaltılması sağlanarak bir amaç gerçekleştirilir.

       Moleküler klonlama,  rekombinant DNA molekülü hazırlamak  üzere yapılan bir işlemdir.  Klonlama yapılmak istenen konak hücre içerisinde  bağımsız bir şekilde bir vektör aracılığıyla çoğalma işlemini gösterir. DNA ligasyonu işlemi ile  klonlanması istenen DNA vektörüne istenilen DNA dizisinin  eklenmesi ile moleküler klonlama gerçekleştirilir. 

         Kullanılan vektör ve  birleştirmesi planlanan  DNA dizilerinin son kısmında  iki tür uç gözlemlenir: Yapışkan ya da küt uç. 

         DNA ligaz işlemi sayesinde katalizleme işlemi gerçekleştirilir.  Bu katalizleme işlemi  DNA dizisinin 3’- OH ve 5’- fosfat  grupları arasında oluşan fosfodiester bağlarında olur.  DNA ligaz enziminin  katalizlediği bu işlem  kullanılan vektör  sirküler  şekline döner ve  klonlama yapılacak konak hücrede   çoğalmaya  hazır hale gelir.

Şekil 1. Transformasyon Yöntemleri

KAYNAKÇA

·         B. YAZICIOĞLU (2022), Kompetan Hücre Hazırlanması, Moleküler Biyoloji Uygulamaları Laboratuvarı II Deney Föyü, Haliç Üniversitesi, İstanbul.

·         B. YAZICIOĞLU (2022), PZR ÜRÜNÜNÜN VEKTÖRE KLONLANMASI, Moleküler Biyoloji Uygulamaları Laboratuvarı II Deney Föyü, Haliç Üniversitesi, İstanbul.

·         Salih, H., Oryaşın, E., & Bozdoğan, B. (2020). pADU94, Kloramfenikol Direncine Sahip Klonlama ve Ekspresyon Vektörü. Turk Mikrobiyol Cemiy Derg, 50(1), 027-034.