Son Dönemlerde Adını Sıkça Duyduğumuz Crispr-Cas9 Metodu Aslında Nedir?

 

Berkay EKİNCİ – Moleküler Biyoloji ve Genetik – İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

 

Yaşadığımız bilimsel gelişmeler ve pandemi süreci ile birlikte PCR, restriksiyon enzimleri, DNA sekanslama ve CRISPR gibi pek çok gen düzenleme tekniğinin adını sıkça duymaya başladık. Bu yazıda sizleri CRISPR-Cas9 metodunun çalışma prensibi ve temel ilkeleri hakkında bilgilendireceğim.

 

 Bunun için öncelikle genetik bilgi içeren DNA’nın ne olduğuna göz atabiliriz. DNA, en temel tabiriyle, adenin, timin, guanin ve sitozin adındaki dört nükleotidin farklı kombinasyonlar ile art arda sıralanması ile o canlıya dair her şeyi (türünü, yapısını, şeklini) belirleyen, ayrıca protein-hormon ve daha nice yapının sentezinde kullanılan genetik koddur [1]. Benzer bir şekilde virüsleri de ‘protein kılıf ile çevrilmiş genetik bilgiyi (DNA-RNA vb.) içeren, başka bir deyişle hücresel oluşuma dair hiçbir organel bulundurmayan; bu sebepten ötürü canlının kendisi tarafından bağışıklık kazanılmadığı sürece onların metabolizmasını ele geçirip kendi genetik materyalini çoğaltarak konak canlıyı (bakteri, hayvan hücresi vb.) işgal eden parazitler şeklinde tabir etmek pek de yanlış olmaz [2]. 

 

Virüslere nasıl tedavi bulunabileceğine dair bakteri bağışıklık sistemi üzerinde yapılan araştırmalar sonucunda bakterilerin halkasal DNA’sında CRISPR (kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik yinelemeler) bölgesi adı verilen bir gen bölgesinin olduğu şans eseri tespit edildi [3]. Hücre dışından gelip hücre içerisine sızan ve bağışıklık kazanılmamış (yani bakteri tarafından tanınmayan) bir virüse ait genetik bilginin (RNA sekanslarının) bakterinin CRISPR bölgesine bağlanması ‘adaptasyon aşaması’ olarak adlandırılır [4]. Bu aşama, bakterinin DNA zinciri üzerindeki CAS (CRISPR Associated [ile ilişkili]) genleri tarafından üretilen özelleşmiş Cas1 proteinlerinin tanınmayan virüse ait DNA sekansını keserek kendi yapısına bağlamasını [5] ve sonrasında bakterinin halkasal DNA’sının içerisindeki CRISPR bölgesideki SPR’lar (kısa palindromik yenilemeler) arasında kalan spacer DNA (birkaç bp uzunluktaki nükleotidlerin bağlanmasının mümkün olduğu boşluklar) [6] kısmına aktarmasını kapsar. Sonrasında CRISPR-RNA (crRNA) Biogenesis (Ortaklığı) adını verdiğimiz aşama [7] olan, bakterinin yeni virüs genomuna özel modifiye edilmiş CRISPR bölgesininin tamamını baştan sona kopyalaması (transcribe etmesi) aşaması gerçekleşir. DNA’nın kodlama zincirinin replike edilmesiyle  oluşan ‘…SPR-viral genom-SPR-viral genom…’  şeklinde devam eden devasa nükleotid dizisi, birkaç enzimin de yardımıyla [8] küçük parçalara ayrılır. Enzimler aracılığıyla yapılan kesim işlemi, transkripsiyon edilen şerit içerisindeki SPR sekanslarının palindromik olmasından ötürü SPR’ların sağından veya solundan gerçekleşebilir [9] ve dolayısıyla ‘SPR + viral genome’ yani crRNA parçaları elde edilir. Bu aşama esnasında oluşan ve virüsün de genetik bilgisi ile tam olarak uyuşacak nükleotid dizilimi içeren bu yeni ve ufak crRNA parçaları; sonrasında bakterinin CAS genleri tarafından kodlanan proteinler (Cas9 vb.) ile birleşerek CRISPR Aracı Kompleksleri (CRISPR Interference Complexes - CSM) [10] oluşumunu sağlar. Bu protein-RNA kompleksinin içerisindeki RNA’nın, virüsün RNA’sı ile tamamıyla eşleşmesinden ötürü de virüsün tutulumu sağlanır. Peki burada bahsi geçen protein olan Cas9 tam olarak nedir? 

 

Cas9 (ikili RNA eşliğinde endonükleaz ve helikaz enzim-protein kompleksi), hedeflenen DNA’nın çift zincirini kıran helikaz ve bu DNA parçalarını kesen nükleaz enzimlerini içeren bir proteindir ve bakterinin CRISPR bölgesinin replike edilmesiyle elde edilen crRNA parçalarıyla ribonükleoprotein (RNP) kompleksi oluşturur [11]. TracrRNA (TrcrRNA) dediğimiz bir başka yapı ise crRNA’e bağlanarak CRISPR-RNA’nın belli bir noktada sabit bir şekilde kalmasını ve stabilizasyonunu [12] sağlar. TrcrRNA ve crRNA chimira (kompleksi), guide RNA (gRNA) olarak adlandırılır [13]. Laboratuvarlarda gRNA ve sgRNA’in (single guide RNA) kelime anlamları maalesef ki karıştırılmaktadır. sgRNA, Cas9 proteinlerinin yapısına bağlanarak kullanılan  tracrRNA&crRNA çiftini kapsamaktadır [13]. gRNA ise Cas12 vb. proteinlerinin yapısına bağlanarak kullanılan tekli crRNA sekansını kapsamaktadır.

 

Bakteri (E.Coli) bağışıklık sisteminde tracrRNA ile crRNA’yı birbirine bağlamak için özelleşmiş bir  bağ (short linker) sekansı söz konusu değilken laboratuvarlarda CRISPR-Cas9 ile yapılacak olan çalışmalarda bu protein-RNA kompleksinin etkinliğini arttırmak yani doğru bir şekilde kesim işlemini yapmasını sağlamak için yapay yollarla crRNA ile trcrRNA arasına GAAA sekansı [13] gibi bağlar eklenmektedir. Cas9 proteinlerindeki bu gRNA kompleksinin yapısını değiştirerek üzerinde değişiklik yapılması planlanan herhangi bir nükleotid sekansı için Cas9 proteinini özelleştirmek mümkündür. Bu sayede Cas9 proteinleri genom analizi yapılmış herhangi bir canlının hedeflenmiş DNA sekansını keserek mutasyona uğratmak (inaktive etmek [knock-down], delesyona uğratmak, yeni bir gen [host RNA] eklemek [knock-in]) için kullanılabilir. Bu işlem, Cas9 proteinine bağlanmış olan gRNA’in kapsadığı crRNA’in koduna karşılık gelen canlının DNA’sındaki nükleotid dizilimine bağlanmasıyla gerçekleşir [11]. crRNA’nın bağlandığı canlının DNA şeridinin hemen bitişiminde kalan 3-4 nükleotidlik kısa PAM (Protospacer Adjacent Motif – Protoaralık Bitişik Motifleri) sekansı ile Cas9 proteinleri üzerindeki endonükleazlar birbirlerine özgüdür ve başarılı bir kesim işleminin gerçekleşmesi için PAM sekansının ve endonükleazın uyuşması [14] gerekmektedir. Tüm şartlar sağlandığı taktirde kesim işlemi gerçekleşir ve hedeflenen sekans elde edilir. Bu işlem esnasında crRNA’nın canlının DNA’sındaki aynı sekansı içeren başka bölgelere bağlanmasından ötürü meydana gelebilecek hedef dışı (off-target) kesimler [15] söz konusu olabilmektedir. Bu sebepten ötürü crRNA ve PAM motifinin uyumlu olacak şekilde belirlenmesi, off-target durumlarının azalmasında ve istenen genin kesilmesinde önemli yer tutar.

 

Referanslar

1.   Ghannam JY, Wang J, Jan A. Biochemistry, DNA Structure,  Molecular. [Updated 2021 Jul 22]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK538241/

2.   Taylor M. W. (2014). What Is a Virus?. Viruses and Man: A History of Interactions, Definition of a Virus, 23–40. https://doi.org/10.1007/978-3-319-07758-1_2

3.   Karginov, F. V., & Hannon, G. J. (2010). The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Molecular cell, 37(1), 7–19. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2009.12.033

4.   Mosterd C, Rousseau GM, Moineau S. A short overview of the CRISPR-Cas adaptation stage. Can J Microbiol. 2021 Jan;67(1):1-12. doi: 10.1139/cjm-2020-0212. Epub 2020 Jun 19. PMID: 32559396.

5.   Makarova, K. S., & Koonin, E. V. (2015). Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1311, 47–75. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2687-9_4Classification of CRISPR-Cas Systems

6.   Shmakov SA, Sitnik V, Makarova KS, Wolf YI, Severinov KV, Koonin EV. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes, abstract. mBio. 2017 Sep 19;8(5):e01397-17. doi: 10.1128/mBio.01397-17. PMID: 28928211; PMCID: PMC5605939.

7.   Heidrich N., Dugar G., Vogel J., Sharma C.M. (2015) Investigating CRISPR RNA Biogenesis and Function Using RNA-seq. In: Lundgren M., Charpentier E., Fineran P. (eds) CRISPR. Methods in Molecular Biology, vol 1311. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2687-9_1

8.   Karvelis, T., Gasiunas, G., Miksys, A., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2013). crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus. RNA biology, Discussion, 10(5), 841–851. https://doi.org/10.4161/rna.24203

9.   Anjana, R., Shankar, M., Vaishnavi, M. K., & Sekar, K. (2013). A method to find palindromes in nucleic acid sequences. Bioinformation, abstract, 9(5), 255–258. https://doi.org/10.6026/97320630009255

10.              You L, Ma J, Wang J, Artamonova D, Wang M, Liu L, Xiang H, Severinov K, Zhang X, Wang Y. Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference. Cell. 2019 Jan 10;176(1-2):239-253.e16. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.052. Epub 2018 Nov 29. PMID: 30503210; PMCID: PMC6935017.

11.              Redman, M., King, A., Watson, C., & King, D. (2016). What is CRISPR/Cas9?. Archives of disease in childhood. Education and practice edition, 101(4), 213–215. https://doi.org/10.1136/archdischild-2016-310459

12.              Liao C, Beisel CL. The tracrRNA in CRISPR Biology and Technologies. Annu Rev Genet. 2021 Nov 23;55:161-181. doi: 10.1146/annurev-genet-071719-022559. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34416117.

13.              Wilkinson, R. A., Martin, C., Nemudryi, A. A., & Wiedenheft, B. (2019). CRISPR RNA-guided autonomous delivery of Cas9. Nature structural & molecular biology, box 1, 26(1), 14–24. https://doi.org/10.1038/s41594-018-0173-y

14.              Gleditzsch, D., Pausch, P., Müller-Esparza, H., Özcan, A., Guo, X., Bange, G., & Randau, L. (2019). PAM identification by CRISPR-Cas effector complexes: diversified mechanisms and structures. RNA biology, 16(4), 504–517. https://doi.org/10.1080/15476286.2018.1504546

15.              Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., & Yang, S. H. (2015). Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids, 4(11), e264. https://doi.org/10.1038/mtna.2015.37