HİSTOKİMYA ve HİSTOKİMYASAL YÖNTEMLERDE KULLANILAN BOYALAR

 

Zeynep Anaz – Moleküler Biyoloji ve Genetik,  Haliç Üniversitesi

HİSTOKİMYA NEDİR?

Maddeleri doku ya da hücre içerisinde mikroskop ile inceleme yapmak için görünür bir hale getiren özel bir kimyasal metoda histokimya ismi verilir. Ayrıca histokimya maddeleri doku ve hücre seviyesinde incelemeye yarayan, miktarlarını ve nasıl yerleştiklerini tespit edilmesine yardımcı olan kimyasal yöntemlerin ortak adıdır. Reaktif gruplar, özgün maddeler ve enzim katalizörleri bu amaç nedeniyle kullanılabilir.(Doran, 2005) Histoloji metotlarında takip edilen süreç doku takibi şeklinde isimlendirilir. Dokunun desteklenmesi için gereken sertlikte olan bir katı alana gömmek amacıyla da doku takibi yapılmaktadır. Genellikle histoloji metotu uygulanan dokular cansız şekilde gözlemlenir. Bazı dokular vital boyalar aracılığıyla canlı olarak gözlemlenebilir. Canlı gözlemlenen dokulara kurbağa yavrusunun kuyruğu, mezenteryum ve spermatozoon örnek olarak gösterilebilir. İdeal histokimyasal boyamanın yapılabilmesi için; test edilen parçanın dokudaki konumu ya da korunmasında bir yetersizlik olmamalı, bütün reaktifler doku ya da hücreye aynı derecede nüfuz etmeli, son renklendirilen tepkime ürünü belirlenir ve bu boya kalıcı olmalıdır (Doran, 2005). Çoğunlukla histokimyasal reaksiyonlar dört temel grupta incelenir. Bunlar basit şekilde oluşan iyonik etkileşimler, gümüş bileşikleri ya da aldehitlerin Schiff reaktifi aracılığıyla oluşan reaksiyonlar, enzimlerin primer tepkimesi sonucunda oluşan ürünlerinin renkli çökelti haline gelmesi, proteinler ya da hormonlarda bulunan aromatik tuzlar ile aromatik diazonyum taşlarının birlikte bulunmasıdır.

 

 

 Şekil 1: Dokuların mikroskop altında incelenmesi

 

DOKULARIN BOYANMASINDA KULLANILAN BOYALAR

Boyanmayan parafin kesitlerde doku bileşeninin birçoğu renksiz şekilde gözükür. Işık mikroskobu ile gözlem yapılan histolojik dokuyu ayırt etmek zordur. Bundan dolayı doku kesitlerine boyama işlemi yapmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Farklı doku ve hücre kısımları, boyaları farklı şekilde tutar. Bu özellik boyamanın kaynağını meydana getirir. Boyalar genel boya ve özel (seçici) boyalar olmak üzere iki grup altında incelenmektedir. Genel boyalar doku bileşenlerinin tümünü boyar. Özel (seçici) boyalar doku bileşenlerine ait spesifik kısımları boyar.

Bazı doku parçaları boyalar ile birleştiği zaman boyanın kendi renginden ve dokunun diğer bölümlerinden oluşan renkten daha farklı bir renk meydana getirir. Bu boyalar metakromatik boya olarak adlandırılmaktadır.

Genellikle dokuların boyanması amacıyla asit ve bazik boyalar uygulanmaktadır. Asit boya ile boyanan doku bölümlerine asidofil, bazik boya ile boyanan doku kısımlarına bazofil ismi verilmektedir. Genellikle bazik boyalar ile boyanan dokular mavi-mor renkte, asit boyalar kullanılarak boyanan dokular ise pembe-kırmızı renklerde gözükür. Eozin, asit fuksin, pikrit asit, orange G, anilin mavisi ve kongo kırmızısı asit boyalara örnek olarak gösterilebilir. Hematoksilin, metilen mavisi, bazik fuksin, karmin, safranin ve toluidin mavisi bazik boyalara örnek gösterilebilir. Çoğunlukla birden çok boyama yöntemi bir arada uygulanarak boyama işlemi gerçekleştirilir. Periyodik asit schiff (PAS), alcian blue-PAS, best carmin ve aldehit fuksin-alcian blue glikojen boyalarına örnek gösterilebilir. Asit fosfataz, kolin esteraz ve alkalen fosfataz enzim boyalarına örnek verilebilir. Çoklu boyalara örnek olarak Van Gieson, mallori azan ve masson trichrom gösterilebilir. Metal boyalar gümüş tuzları, osmiyum, altın, kurşun ve civa olarak sayılabilir. Yağ dokusu boyaları sudan, nil mavisi, oil red o, Scharlac kırmızısıdır. Yalnızca bir tane boyama metotu uygulanabilir. Fakat dokunun özelliğine göre yapılan boyamalar farklılık gösterebilir. Gözlem yapılacak dokuya uygun boya ve boyama yöntemi belirlenmelidir.

HİSTOKİMYASAL BOYAMA VE KULLANILAN BOYALAR

Birçok organik ve inorganik maddelerin doku içerisindeki yerleştiği konum ve miktarını ortaya koyan bir çalışma yöntemine histokimyasal boyama adı verilir. Bu yöntem gözlem yapılacak madde üzerine, madde ile reaksiyona giren renkli bir maddenin çöktürülmesi ile yapılmaktadır. Yalnızca gözlemlemek istenilen bölümün boyanması en önemli özelliktir. Örneğin, Prusya mavisi yardımıyla doku içerisinde yer alan demir gözlemlenebilir ve miktarı belirlenebilir. PAS yöntemi uygulanarak polisakkaritler ve miktarı incelenebilir.

Histokimyasal boyalardan en çok kullanılanlar PAS, alcien–blue-PAS, toluidin mavisi, Masson trikrom, retikülin, Van gieson, oil red o, mason fontana, MGP’dir.

 

 Şekil 2: Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomunun histokimyasal yöntem ile boyanması

HİSTOKİMYASAL BOYALARIN TANIDA KULLANIMI

Histokimyasal yöntemler deri patolojisinde çok fazla kullanılmaktadır. Kas biyopsi örneklerinin kesitleri hazırlandıktan sonra hemotoksilen eosin ve Masson trikrom boyama metotlarının uygulanması gerekmektedir. Bu şekilde histokimyasal sonuçlar ve histolojik görüntü arasındaki ilişki tartışılmalıdır. Genellikle dejeneratif, demiyelinizan ve depo hastalıkları gibi sinir sistemi rahatsızlıkların tanısının konmasında histokimyanın büyük derecede görevi vardır. Miyelin kılıfın selektif şekilde zarar gördüğü primer demiyelinizan rahatsızlıklarda veya aksonlarda hasara yol açan sekonder demiyelinizan hastalıklarda tanı koymak için histokimyasal metotlar uygulanmaktadır.

Gastrointestinal kanalda yer alan müsinlerin nötral (sialomüsin) ve asidik (sulfomüsin)  özellikleri bulunmaktadır. PAS-alcian blue boyama yöntemi sayesinde asit müsinler mavi veya pembeye yakın mavi renkte gözükür. Nötral müsinler ise bu metot ile koyu mor renkte gözükür.

Karaciğerin histolojik bakımından incelenmesi için histokimyasal boyaların kullanılması rutin haline gelmiştir. Kollajen ve retikülin boyaları kullanılarak karaciğerin yapısal çatısını ve patolojik durumlardaki fibrotik tepkimeler görülür. (Doran, 2005) PAS boyası, diastaz ile bir araya getirilmeden önce karaciğerin glikojen depolama durumun belirlenmesinde görev alır. Aynı zamanda sitoplazmik inklüzyonların durumu gözlemlenir.

Gümüş boyaları bazal zarın gözlemlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. Fibrozis tanıları koymak için masson trikrom kullanılmaktadır. Tümör tanılarının koyulmasında histokimya boyalar immünohistokimyasal boyaların uygulanması için temel meydana getirir. PAS, retikülin, Masson trikrom ve Van gieson bu amaçla kullanılan histokimyasal boyalardır.

Nöroendokrin tümörlerde dens granüller gümüş boyalar kullanılarak incelenebilir. Masson fantona boyama yöntemi kullanılarak melanositik tümörler görülebilir. Toluidin mavisi ağız boşluğunun karsinomunu ve displazisini açıklamak amacıyla vücut dışında kullanılmıştır. Doku kesitlerinde bulunan mast hücre granülleri, kıkırdak ve müsinler gibi bölgeleri incelemek için toluidin mavisi uygulanır.

Şekil 3: Kolon kanserinin histokimyasal boyalar kullanılarak tanı konması

KAYNAKÇA

Doran F (2005), Aegean Pathology Journal, Histokimya, Cilt: 2 Sayı: 62-70 (1)

http://www.turkjpath.org/pdf/pdf_APJ_683.pdf (Erişim Tarihi:13.12.2022)

Sridharan G, Shankar A. A (2012), J Oral Maxillofac Pathol, Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility, Cilt: 16 Sayı: 2 (2)

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22923899/ (Erişim Tarihi:13.12.2022)

Scully C, Porter S (200), ABC of oral health, Swellings and red, white, and pigmented lesions, Cilt:321 (7255) Sayı: 225-228 (3)

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10903660/ (Erişim Tarihi:14.12.2022)

Aksoy E, Aktan T.M, Duman S, Dursunoğlu D, Cüce G (2009), Zeynep Kamil Tıp Bülteni, Farklı Semen Parametrelerinde Işık Mikroskobu Düzeyinde Spermatozoa Morfolojisi ve Nükleer Kondansasyon Değerlendirmesi, Cilt: 40 Sayı:3

https://dergipark.org.tr/tr/pub/zktipb/issue/22070/236948 (Erişim Tarihi:14.12.2022)

Kraus N.A, Ehebauer F, Zapp B, Rudolphi B, Kraus B.J & Kraus D (2016), Adipocyte, Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture, Cilt: 5 Sayı:4 13

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27994948/ (Erişim Tarihi:14.12.2022)

Tuncer E, Özer H, Arıcı D.S, Müslehiddinoğlu A, Göze Ö.F, Köylüoğlu G (2005), Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, Hirschsprung Hastalığında Methyl Green Pyronin İle Ganglion Hücrelerinin Araştırılması, Cilt:27(1) Sayı: 19-23

https://dergipark.org.tr/tr/download/article-file/673676 (Erişim Tarihi:14.12.2022)

Alkan F, Arda O, Ertürkoğlu Ş, Seçkin İ, Taşyürekli M, Koyutürk M, Güzel Meydanlı E (2016). Genel Histoloji Uygulama Kitabı. İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji AD. , İstanbul.

http://nek.istanbul.edu.tr:4444/ekos/KITAP/2015-00289.pdf (Erişim Tarihi:14.12.2022)